A proteinase semelhante à subtilisina (AprBp) de Bacillus pumilus 3-19 é uma candidata promissora para uso industrial como aditivo alimentar. Contudo, a fim de obter um alto rendimento da enzima, é necessário desenvolver um sistema de expressão altamente eficiente.
O objetivo do estudo foi obter expressão estável do gene da protease B. pumilus 3-19 no sistema de expressão de Pichia pastoris e avaliar a correlação da atividade enzimática com a escolha do tipo de vetor e peptídeos sinal. Neste estudo, para a expressão estável do gene de protease otimizado em células de levedura metilotrófica, os vetores pPINK-HC e pPINK-LC foram selecionados. Para secreção extracelular de protease recombinante, um conjunto de peptídeos de sinal eficazes foi usado. A pré-sequência do fator de acasalamento α levou repetidamente a um aumento na secreção de proteínas recombinantes. Por outro lado, as sequências de peptídeos de sinalização assassinos e de lisozima não foram utilizadas anteriormente para a expressão de protease bacteriana em P. pastoris.
Colônias de transformantes com construções baseadas no vetor pPINK-LC foram detectadas no terceiro dia de incubação e mostraram maior eficiência de transformação do que para colônias com construções baseadas no vetor pPINK-HC, que foram detectados apenas no 7º dia de incubação. A eficiência de transformação no 10º dia de incubação para estruturas com base no vetor pPINK-LC foi em média 1,3 × 103 transformantes / μg de DNA, enquanto 1,03 × 103 transformante / μg de DNA foi registrado para construções com o vetor pPINK-HC. A PCR da colônia mostrou que todas as colônias de transformantes selecionadas continham o gene da protease semelhante à subtilisina integrado ao genoma da levedura.
O estudo mostrou que o tempo de incubação afeta a síntese de protease em P. pastoris, e a atividade máxima da enzima foi observada. As cepas de levedura com construtos baseados no vetor de baixa cópia pPINK-LC mostraram maior atividade de protease (U / ml) na hidrólise da azocaseína (2,63 ± 0,16 para o peptídeo sinal killer (SP), 2,49 ± 0,08 para a pré-sequência do fator de acoplamento α, 2,19 ± 0,11 para lisozima SP) do que cepas com construtos baseados no vetor pPINK-HC (1,86 ± 0,09 para assassino SP, 2,21 ± 0,07 para a pré-sequência do fator de acoplamento α, 1,31 ± 0,11 para lisozima SP), independentemente de qual peptídeo sinal foi usado. A atividade máxima de protease foi obtida para cepas de levedura com construções pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U / ml) e pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U / ml).
Este estudo demonstrou que a protease semelhante à subtilisina de cepas recombinantes de P. pastoris exibe atividade proteolítica, que depende do tempo de incubação e da escolha do peptídeo sinal e vetor. A produção de protease bacilar pelo sistema de expressão heterólogo à base de levedura torna este sistema promissor para o desenvolvimento de novos aditivos alimentares para a pecuária.
As proteases são classificadas entre os três maiores grupos de enzimas industriais e respondem por cerca de 60% da venda global total de enzimas, 40% dos quais pertencem a proteases bacterianas. Serina proteases bacterianas têm ampla especificidade de substrato, e alta resistência a várias condições, que garante seu uso em biotecnologia, em particular como bioaditivos para aves e animais de criação. Adicionalmente, a suplementação de rações com proteases aumenta a absorção de aminoácidos pelos animais e economiza fundos para a compra de aminoácidos sintéticos. Também foi demonstrado que o uso de proteases como aditivos para rações aumenta a biodisponibilidade de nitrogênio, que por sua vez reduz os níveis de poluição de amônia no solo. Também, as proteases facilitam a ação de outras enzimas e aumentam o custo-benefício dos alimentos, além de promover o crescimento de microflora benéfica no intestino de frangos de corte.
Hoje, um número limitado de proteases comerciais de fabricantes estrangeiros é usado na Rússia. Os principais representantes no mercado russo são os aditivos para rações importados CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), EUA), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Suíça), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Alemanha). O recombinante obtido compreende cepas de P. pastoris com o gene da protease bacilar semelhante à subtilisina (aprBp) e três peptídeos de sinal diferentes (fator de acasalamento α, proteína assassina e lisozima). Uma maior expressão e purificação da protease do líquido de cultura de levedura e o estudo de suas propriedades bioquímicas e enzimáticas ajudarão a avaliar as perspectivas biotecnológicas da enzima recombinante.
Leia mais sobre o estudo, Expressão heteróloga de Bacillus pumilus 3-19 Protease em Pichia pastoris e seu uso potencial como aditivo alimentar na avicultura
