por Constantinos C Mylonas, Coordenador de Projeto (HCMR, Greee), Birgitta Norberg, Reprodução e genética - Líder do alabote do Atlântico (IMR, Noruega), Kristin Hamre, Nutrição - Líder do Halibut do Atlântico (NIFES / IMR, Noruega), Torstein Harboe, Larval Husbandry - Atlantic Halibut Leader (IMR, Noruega), Sonal Patel, Saúde do Peixe - Líder do Halibut do Atlântico (IMR, Noruega; atualmente em VAXXINOVA, Noruega) e Rocio Robles, Líder de Disseminação (CTAQUA, Espanha)
Uma das espécies incluídas no projeto DIVERSIFY, financiado pela UE, que funcionou entre 2013 e 2018 foi o alabote do Atlântico (Hippoglossus hippoglossus). O linguado do Atlântico é o maior peixe chato do mundo e pode pesar mais de 300 kg. É altamente valorizado em mercados em todo o mundo, mas a disponibilidade de alabote do Atlântico selvagem está diminuindo.
Os estoques noruegueses são classificados como viáveis, mas a pesca está sujeita a uma regulamentação estrita. Isso levou a uma maior demanda do mercado por alabote do Atlântico, que não podem ser atendidos apenas pela pesca.
O linguado do Atlântico (ver figura 1) é um peixe semi-gordo, rico em ácidos graxos ômega-3, com uma característica carne branca escamosa com poucos ossos. O linguado do Atlântico cultivado tem uma excelente reputação e é tradicionalmente comercializado como grandes bifes de peixe ou costeletas. Pode ser fumado ou marinado no típico estilo escandinavo. Essas características levaram à inclusão do alabote do Atlântico em DIVERSIFY, como um grande candidato para a diversificação de espécies de peixes e produtos na aquicultura europeia.
Os esforços de pesquisa e cultivo de alabote do Atlântico começaram na década de 1980, e embora a produção anual total de alabote do Atlântico em cultura esteja aumentando, ainda só atingiu ~ 1600 toneladas em 2017 (Direcção das Pescas da Noruega).
Na Europa, Existem fazendas de alabote do Atlântico na Noruega e na Escócia. O tamanho de mercado desejado é de 5 a 10 kg e o tempo de produção atualmente é de quatro a cinco anos. Apesar de um esforço significativo de pesquisa entre 1985 e 2000, o complicado ciclo de vida do alabote do Atlântico tornou o progresso da aquicultura lento, e muito pouco financiamento de pesquisa foi alocado depois disso.
Contudo, durante este tempo, um progresso lento, mas constante, foi feito pelos agricultores a fim de melhorar a estabilidade da produção, e o interesse pela cultura em gaiolas e terrestres está crescendo. Os gargalos restantes para o aumento e estabilidade da produção estão relacionados ao fornecimento constante de alevinos e à necessidade de diminuir o tempo de produção.
O último pode ser alcançado com o recente estabelecimento da produção juvenil “exclusivamente feminina”. Espera-se que isso tenha um grande impacto no tempo de produção, pois as fêmeas crescem mais rápido e amadurecem mais tarde - 80% dos peixes abatidos com menos de 5 kg são machos maduros.
O projeto DIVERSIFY abordou esses gargalos importantes com um esforço de pesquisa coordenado em reprodução, nutrição larval e criação e desenvolvimento de vacinas. A combinação de biológicos, Prevê-se que as atividades de investigação tecnológica e socioeconómica desenvolvidas em DIVERSIFY apoiem a diversificação da indústria aquícola da UE e ajudem a expandir a produção, aumento dos produtos da aquicultura e desenvolvimento de novos mercados.
Reprodução
A pesquisa em nosso projeto confirmou que as fêmeas capturadas na natureza reproduzem de forma confiável e produzem ovos de maneira consistente e de qualidade muito alta (> 85% de fertilização). As fêmeas cultivadas também produziram ovos de alta qualidade quando seus ciclos ovulatórios foram identificados, e a remoção foi realizada perto da ovulação (ver figura 2).
Para produção comercial, bem como propósitos de reprodução, não é prático confiar em fêmeas capturadas na natureza. Contudo, relativamente poucas fêmeas cultivadas produziram ovos consistentemente com taxas de fertilização> 80-85 por cento. Como consequência, pode ser necessário incluir reprodutores capturados na natureza também em futuros grupos de reprodução, a fim de garantir um material genético amplo o suficiente.
As concentrações plasmáticas de esteróides sexuais em criadores foram semelhantes ao que foi relatado anteriormente no halibute do Atlântico, com perfis anuais seguindo o crescimento e maturação ovariana. Os níveis mais altos de 17β-estradiol (E2) foram registrados imediatamente antes da desova, no começo de fevereiro, enquanto tanto E2 quanto testosterona (T) permaneceram elevados durante o período de desova.
Nenhuma diferença nas concentrações médias foi observada entre as fêmeas capturadas na natureza e cultivadas. As concentrações plasmáticas do hormônio folículo estimulante gonadotropinas (FSH) e do hormônio luteinizante (LH) foram documentadas pela primeira vez no halibute do Atlântico.
As concentrações médias de FSH foram relativamente estáveis durante a vitelogênese, de outubro ao início de fevereiro, consistente com uma liberação constitutiva de FSH da pituitária. O FSH plasmático diminuiu para níveis baixos durante a desova, mas aumentou novamente após o término da desova.
As concentrações plasmáticas de LH mostraram grandes variações individuais ao longo do ciclo reprodutivo, mas altos níveis foram detectados durante a desova. Isso foi consistente com os resultados relatados anteriormente em outros teleósteos, incluindo uma série de peixes chatos.
A implantação com agonista do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRHa) não avançou significativamente o tempo de desova em fêmeas de alabote do Atlântico, mas uma sincronização aparente no tempo de desova entre os indivíduos foi vista, já que as fêmeas tratadas haviam completado a desova um mês antes de os peixes de controle serem gastos. Na produção comercial, a sincronização entre os indivíduos pode ser uma vantagem, pois os esforços da equipe na coleta de ovos podem ser concentrados em um período relativamente curto (ver figura 3).
Criadores de alabote do Atlântico precisam ser monitorados quanto à ovulação e despojados regularmente, e os ovos são fertilizados in vitro. Portanto, o uso da implantação de GnRHa oferece uma vantagem logística para o manejo comercial de reprodutores da espécie, reduzindo a época de desova.
Nutrição
Para o desenvolvimento de um protocolo para o desmame precoce de larvas de alabote do Atlântico, encontramos uma grande diferença em relação ao consumo de ração das larvas em três dietas comerciais diferentes, 28 dias após a primeira alimentação (dpff) (ver figura 4).
As larvas alimentadas com a dieta larval marinha comercial Otohime (Japão) estavam com os intestinos cheios após cinco dias de alimentação. Esta dieta foi usada em um experimento com o objetivo de encontrar a primeira época do desmame aos 15 anos, 22 e 28 dpff. O desmame com 15 dpff resultou em quase 100 por cento de mortalidade, a 22 dpff, aproximadamente 30 por cento de mortalidade e a 28 dpff, quase zero por cento de mortalidade.
A conclusão foi que as características da dieta são importantes para garantir o consumo de ração em larvas de alabote do Atlântico e que as larvas estão prontas para se alimentar de uma ração formulada apenas aos 28 dpff. Mais experimentos são necessários para avaliar se as larvas iniciais crescem e se desenvolvem bem com essas dietas.
Também, um protocolo para produção de Artemia em crescimento foi desenvolvido e a composição de nutrientes foi analisada. Artemia cultivada por três dias no meio de cultura ORI-culture (Skretting, Espanha) e depois enriquecido com o meio LARVIVA Multigain (Biomar, Dinamarca) obteve um perfil nutricional melhorado em muitos aspectos.
A proteína, os teores de aminoácidos livres e taurina aumentaram, lipídios e glicogênio diminuíram, enquanto a proporção de fosfolipídios (PL) para lipídios totais (TL) aumentou. A composição de ácidos graxos melhorou em um experimento, mas não no realizado no parceiro comercial. Os perfis de micronutrientes não foram afetados negativamente pela cultura de Artemia no meio de cultura ORI.
Uma vez que pesquisas anteriores descobriram que larvas alimentadas com Artemia crescida se desenvolviam em juvenis com melhor qualidade, as larvas foram alimentadas com Artemia crescido em comparação com náuplios de Artemia convencionais em DIVERSIFY (ver figura 5).
Não houve diferenças no crescimento, a pigmentação ou migração ocular entre os dois grupos e a composição de nutrientes das larvas após três semanas de alimentação eram muito semelhantes. A conclusão foi que os náuplios de Artemia produzidos com métodos modernos têm níveis de nutrientes suficientes para cobrir as necessidades das larvas de alabote do Atlântico.
Também, a hipótese de que larvas criadas em sistemas de recirculação de aquicultura (RAS) teriam outra microflora no intestino e, Portanto, têm absorção diferente de nutrientes foi examinado. Contudo, exceto para níveis mais elevados do derivado da vitamina K MK6, não encontramos diferenças na utilização de nutrientes entre as larvas criadas em RAS ou sistemas de fluxo.
Finalmente, Juvenis de alabote do Atlântico (um grama de peso corporal) foram alimentados com dietas com cinco níveis de PL variando de 9 a 32 por cento do TL. Não houve efeitos dos níveis de PL no crescimento ou composição lipídica no intestino, fígado e músculo, 24 horas após a alimentação.
Contudo, tempo após a refeição afetou a composição lipídica do tecido intestinal, com níveis mais elevados de lipídios neutros uma e quatro horas pós-prandial, e níveis mais elevados de lipídios polares, ésteres de colesterol e ceramida em 24 horas pós-prandial, refletindo a absorção dos lipídios logo após a refeição.
Parece que os juvenis de alabote do Atlântico regulam sua composição de espécies lipídicas para serem independentes da dieta quando uma faixa de PL / Triacilglicerol é aplicada, como no presente estudo (ver figura 6).
Criação de larvas
Um protocolo para o cultivo de náuplios de Artemia foi desenvolvido e descrito. O uso de Artemia em crescimento durante o período crítico de metamorfose em larva de alabote do Atlântico não diferiu do uso de náuplios de Artemia no que diz respeito ao crescimento, mortalidade e qualidade dos alevinos. Além disso, a produção de Artemia cultivada era muito trabalhosa, e altos custos de pessoal podem ser proibitivos na implementação desta fonte de alimentação viva na larvicultura comercial.
A produção comercial de alevinos de alabote do Atlântico é atualmente realizada em sistemas de fluxo contínuo (FT), embora haja um consenso crescente de que um RAS ofereceria parâmetros de água ambientais e químicos mais estáveis que levariam a um melhor desempenho larval.
Os protocolos de produção para o saco vitelino e as larvas da primeira alimentação em RAS foram desenvolvidos em DIVERSIFY. Nenhuma diferença na sobrevivência foi detectada entre a criação de RAS e FT durante a incubação do saco vitelino. Quando os sistemas foram preparados por um mês, o crescimento larval foi significativamente maior no grupo RAS durante a primeira alimentação. Alta mortalidade ocorreu em um dos tanques FT.
Tomados em conjunto, resultados sugeriram que com condicionamento adequado do RAS, um sistema estável é estabelecido onde o crescimento e a sobrevivência das larvas são tão bons quanto, ou melhor do que em sistemas FT com condições ideais. O RAS foi um sistema de criação mais estável para larvas de alabote do Atlântico em comparação com o sistema FT.
A caracterização metagenômica das comunidades bacterianas em água de criação e larvas revelou que pelo menos 300-400 gêneros bacterianos diferentes estavam presentes nos sistemas de criação. Diferenças significativas foram detectadas na composição da microbiota dos sistemas RAS e FT:tanto em silos quanto em tanques, e na água e nas larvas.
Nenhuma correlação óbvia foi observada entre a microbiota da água e a microbiota das larvas. A caracterização da composição da microbiota fornece informações importantes para o desenvolvimento do tratamento probiótico de larvas de alabote do Atlântico.
Saúde do peixe
A fim de desenvolver uma vacina contra a necrose neural viral para larvas de alabote do Atlântico, a proteína do capsídeo do Nodavírus foi expressa com sucesso de forma recombinante em três sistemas diferentes; E. coli, Leishmania tarentolae e na planta do tabaco, e como esperado houve variação na quantidade de expressão entre os sistemas.
Além disso, a proteína do capsídeo recombinante expressa em Pichia foi fornecida pelo projeto da UE TARGETFISH. Estes quatro sistemas de expressão diferem na forma como as proteínas expressas são glicosiladas pós-tradução. Ao construir e usar E. coli e Leishmania tarentolea expressando proteína fluorescente verde (GFP), pode ser visualizado por microscopia de fluorescência que Artemia filtrou com eficiência e ingeriu esses micróbios, e, assim, a proteína recombinante portadora.
Artemia ingeriu proteína da cápside de Nodavírus recombinante expressa pelos vários sistemas, que pode ser confirmado por immunoblotting.
A proteína do capsídeo recombinante expressa pelo sistema diferente foi então alimentada para Artemia, que foram alimentados com larvas de alabote do Atlântico a 100 dph. Dez semanas depois, os juvenis em todos os grupos de tratamento foram desafiados por uma injeção i.p. injeção (ver figura 7) com Nodavírus para verificar a eficácia.
Os peixes desafiados foram eliminados oito semanas após o desafio e testados quanto à presença de Nodavírus no cérebro por RT-PCR em tempo real visando o segmento de RNA2 viral. Nenhuma diferença significativa pode ser vista entre os diferentes grupos de tratamento, incluindo o grupo com proteína recombinante que mostrou proteção anteriormente.
Isso indica que o tamanho do peixe e a necessidade de separar os peixes para minimizar a grande variação entre indivíduos em diferentes fases no momento da vacinação têm suas limitações inerentes e devem ser cuidadosamente considerados.
Para concluir, embora tenha sido demonstrado que Artemia irá absorver e acumular as várias formas de proteínas da cápside do Nodavírus recombinante e atuar como um vetor para distribuição oral a larvas de alabote do Atlântico, os experimentos de desafio indicam que esta estratégia de entrega de antígeno não induz proteção contra a infecção por Nodavírus, pelo menos nas condições usadas neste estudo.
Um manual técnico de produção foi produzido para o alabote do Atlântico e pode ser baixado do site do projeto em www.diversifyfish.eu.
Este projeto de 5 anos (2013-2018) recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro de Pesquisa da União Europeia, desenvolvimento tecnológico e demonstração (estágio único KBBE-2013-07, GA 603121, DIVERSIFICAR).
O consórcio inclui 38 parceiros de 12 países europeus - incluindo nove PME, duas grandes empresas, cinco associações profissionais e uma ONG de consumidores - e foi coordenado pelo Centro Helênico de Pesquisa Marinha, Grécia.
