por Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Blue Aqua International Group of Companies, Tailândia
A aquicultura de camarão foi dramaticamente afetada por muitas doenças patogênicas, causada principalmente por V. parahaemolyticus e vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de uso de dois aditivos funcionais para rações AlphaGuard * L Plus (Líquido) e AlphaGuard * P (Pó) compostos de óleos essenciais (eucalipto, Tomilho, orégano pertencente à família Myrtaceae e Lamiaceae respectivamente), Triglicerídeos de cadeia média (MCTs) e compostos bioativos naturais em camarões contra patógenos causados por doenças, especialmente V. parahaemolyticus e WSSV.
Os resultados indicaram que AlphaGuard * L Plus efetivamente retardou o progresso da doença em camarões. Esses resultados sugerem que o aditivo alimentar funcional de AlphaGuard * P e AlphaGuard * LPLUS pode ser usado para promover a defesa do camarão contra patógenos.
Introdução
A prática de intensificação da aquicultura é impedida pela saúde e nutrição que afetam o desempenho do crescimento. Para desembaraçar essas consequências, aditivos funcionais para rações têm sido usados para estimular a imunidade ao camarão e melhorar o desempenho do camarão, especialmente para controlar patógenos virais e bacterianos no tratamento recente de doenças do camarão, como V. parahaemolyticus que causou a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) e o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) que causou a mancha branca Doença (WSD), combinado com a implementação de medidas de biossegurança.
A composição do AlphaGuard que compõe o MCT e o óleo essencial está sendo reconhecida como prática GRAS. Neste estudo, a eficiência do produto AlphaGuard foi obtida por uma combinação dos dados dos resultados do teste de difusão em disco, desafios da doença e histologia, junto com uma avaliação dos efeitos do produto AlphaGuard nas doenças do camarão.
materiais e métodos
Bactérias e vírus patogênicos
Dois patógenos virulentos no camarão, V. parahaemolyticus e V. harveyi em estoque de glicerol, foram sub-cultivadas em caldo de soja tríptico (TSB) + um por cento de NaCl, incubado a 37oC por 24 horas, antes de semeadas em ágar tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose para obter sua cultura pura.
A suspensão de WSSV foi preparada a partir do músculo de camarão infectado com WSSV. Brevemente, o WSSV contendo no músculo do camarão foi removido do armazenamento a -80 ° C e cortado em pedaços uniformes sob condições estéreis frias, em seguida, homogeneizado em tampão TN (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) a 0,1 g / ml.
Após a centrifugação a 2, 000 rpm por 10 minutos a 4 ° C, o sobrenadante foi diluído a 1:100 com NaCl a 0,9 por cento e filtrado através de 0,45 mícron. O sobrenadante resultante foi armazenado a -80 ° C, até que foi usado como uma fonte de injeção de WSSV para os experimentos de desafio.
A atividade antimicrobiana
Teste de disco-difusão
5 µl de AlphaGuard * L Plus e AlphaGuard * P, concentração variando de 0, 0,25, 0,5, Diluição de 1,0 e 10 por cento com NaCl 0,85 por cento, foram absorvidos em cinco milímetros de diâmetro, Discos de papel com 0,9 mm de espessura foram então secos ao ar antes de serem colocados em 105 células de cultura de bactérias em uma placa de Petri de 100 x 15 mm de largura. Solução NaCl a 0,85 por cento foi usada como controle negativo. Três placas replicadas para cada tratamento foram usadas e as observações foram registradas após 24 horas.
Infecção artificial por V. parahaemolyticus e determinação do número de Vibrio na hemolinfa (HL) e no hepatopâncreas (HP) de camarão
V. parahaemolyticus foi reativado do armazenamento a -80 ° C e cultivado em TSB + NaCl a um por cento a 37 ° C durante a noite. A cultura foi centrifugada a 5, 000 rpm por 10 minutos, para remover o sobrenadante, e o sedimento foi ressuspenso em NaCl a 0,85 por cento estéril até uma densidade de 8,4 x 106 CFU / ml.
O camarão, na quinta semana, foram infectados pela injeção de 100 μL da suspensão bacteriana no segundo segmento abdominal de camarão saudável na quinta semana de cultivo e a mortalidade foi registrada por sete dias.
Os camarões foram coletados aleatoriamente no terceiro dia após a infecção para cada tratamento e lavados três vezes com água estéril. O HL foi retirado da cavidade pericárdica usando uma seringa descartável estéril de um mL sob condições estéreis e adicionado a um volume igual de anticoagulante estéril (adicionando 10 mM EDTA-Na2 a 450 mMNaCl, 10 mMKCl, HEPES 10 mM, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 ou Tris-HCl 10 mM, Sacarose 250 mM, Citrato de sódio 100 mM, pH 7,6).
O HL e o HP moído foram diluídos em série 10 vezes com PBS estéril frio. Cada diluição foi espalhada em placas de ágar TCBS colocadas de cabeça para baixo em uma incubadora a 37 ° C e cultivadas por 16–20 horas. Placas contendo 30-300 colônias bacterianas foram contadas, em seguida, os números foram registrados como UFC / ml ou UFC / g.
Infecção artificial com WSSV
ml do filtrado foi injetado por via intramuscular em camarão saudável na quinta semana de cultivo. Os camarões foram coletados aleatoriamente seis horas após a infecção para exame histopatológico e a mortalidade f foi registrada por sete dias.
Condições de crescimento do camarão e grupos experimentais
O camarão era comprado em fazendas tailandesas locais. Eles foram testados negativos para V. AHNPD e WSSV causados por parahaemolyticus por análise de PCR. Depois de se aclimatar por uma semana em um aquário, antes do experimento, camarões aparentemente saudáveis com comprimento corporal uniforme foram divididos aleatoriamente em três grupos com seis repetições por grupo, 20 camarões por réplica.
A capacidade do aquário era de 100 litros, contendo 60 litros de água do mar. A propriedade da água salina foi mantida em 15 ppt, pH 7,7-8,0 e DO> 4,0 mg / L. Cada tratamento contém camarões juvenis com peso médio inicial de 2,6 g estocados aleatoriamente em cada tanque.
Os camarões foram alimentados até a saciedade até cerca de 2,5-3 por cento de seu peso corporal, três vezes por dia durante cinco semanas. A alimentação foi ajustada diariamente, de acordo com sua taxa de ingestão, para ter certeza de que a ração foi totalmente consumida. Antes de alimentar, mudas, fezes, e camarões mortos foram removidos, 20 por cento da água em cada tanque era trocada a cada três dias por nova água do mar.
Dietas experimentais e coleta de dados
Todos os grupos foram mantidos, durante o experimento, sob as mesmas condições da aclimatação. O grupo de controle foi alimentado com pellets comerciais de camarão, revestido com quitina-quitosana a um por cento. Os grupos de tratamento foram alimentados por AlphaGuard * L Plus pulverizado ou AlphaGuard * P, misturado com pelotas de camarão comercial e revestido por um por cento de quitina-quitosana, na dosagem de 5,0 ml ou g / kg de ração. Os parâmetros de mortalidade e qualidade da água foram registrados diariamente. No final do julgamento, a taxa de sobrevivência foi avaliada.
Análise estatística
Unidades experimentais de análise estatística, tanques, e os aquários foram distribuídos de forma totalmente aleatória. Os dados quantitativos foram verificados quanto à normalidade e homocedasticidade. Os dados foram analisados por meio de análise de variância (ANOVA) de uma via para procurar diferenças significativas (p <0,05) entre as médias de tratamento.
Resultados
A atividade antibacteriana por métodos de difusão em disco e inclusão na dieta de camarões na resistência a doenças de AlphaGuard * L Plus ou AlphaGuard * P
Teste de disco-difusão
As concentrações de AlphaGuard * L Plus e AlphaGuard * P inibem pelo menos um por cento de V. harveyi e V. parahaemolyticus, Contudo, houve maior eficácia de inibição para V. parahaemolyticus em comparação com V. harveyi. A concentração efetiva de AlphaGuard pode ter sido reduzida se diluíssemos em solúveis lipídicos, como o etanol, para teste.
Composições de óleo essencial, técnicas de ensaio e o modo de ação foram intensamente revisados. Este estudo não investigou em detalhes moleculares para seus mecanismos, Contudo, o principal efeito das propriedades bactericidas pode estar relacionado à sua interferência na integridade e permeabilidade da membrana como o composto lipofílico do óleo essencial e MCTs.
Diferentes ácidos graxos em MCTs têm diferentes concentrações inibitórias mínimas (MIC), dependendo do tipo de ácido graxo, microrganismo, e pH ambiental. O aspecto sinérgico e antagônico entre os ingredientes de AlphaGuard não é elucidado neste estudo. O óleo essencial em AlphaGuard também atua como um antioxidante para prevenir ou retardar a oxidação de MCTs insaturados para prolongar sua vida útil, além de anti-estresse em camarões.
Teste de desafio de V. parahaemolyticus
No final do experimento de teste de feed, camarões foram desafiados por V. parahaemolyticus. A taxa de mortalidade cumulativa foi traçada (veja a figura dois). Os resultados da taxa de mortalidade, após o desafio com V. parahaemolyticus por um intervalo de sete dias, mostraram que os grupos de camarões alimentados com AlphaGuard * P e AlphaGuard * L Plus tiveram taxas de mortalidade significativamente mais baixas do que em comparação com o grupo de controle após o quarto dia de infecção.
Tanto o AlphaGuard * P quanto o AlphaGuard * L Plus tiveram a mesma taxa de mortalidade estatística após o quinto dia de infecção. No final do experimento, em contraste, a taxa de sobrevivência não foi estatisticamente correlacionada à taxa de mortalidade para AlphaGuard * P, (veja a figura três).
A capacidade de eliminação de camarões de Vibrio spp. após três dias de infecção foi traçado, (veja a figura quatro). Os resultados indicaram que o Vibriospp. a contagem na hemolinfa de camarões alimentados com AlphaGuard * P e AlphaGuard * LPlus foi menor do que nos grupos controlados. A capacidade do camarão de se defender contra bactérias em HP, alimentado por AlphaGuard * LPlus, também tinha uma capacidade de defesa muito melhor do que os camarões não alimentados com AlphaGuard.
Teste de desafio WSSV
O teste de desafio com WSSV foi conduzido após cinco semanas do teste de alimentação. A mortalidade cumulativa foi traçada, (veja a figura cinco). O grupo de camarões alimentados por AlphaGuard * L Pluss mostrou atraso significativo na mortalidade, em comparação com os grupos de controle e AlphaGuard * P-fedshrimp durante seu segundo, terceiro e quarto dias, (veja a figura seis).
Isso coincidiu com a ausência de sinal histopatológico de tecido de infecção de WSSV com coloração de H&E na área de injeção, exceto a generalização da necrose muscular que provavelmente está relacionada ao mecanismo de defesa do camarão após três dias de infecção. No entanto, todos os grupos terminaram com 100 por cento de mortalidade.
Conclusão
Os resultados deste ensaio sugeriram que a aplicação do aditivo alimentar AlphaGuard * P e AlphaGuard * L Plus a 0,5 por cento com ração comercial comprovou a eficácia na promoção da defesa do camarão contra patógenos. AlphaGuard * L Plusesespecialmente exibiu um melhor desempenho.
