Técnicas de cultura de tecidos

Técnicas de cultura de tecidos em plantas, Procedimento de empréstimo de configuração para cultura de tecidos e cultura de tecidos.

Introdução:

O que é cultura de tecidos? A cultura de tecidos é o cultivo de uma planta durante o uso de uma estaca ou outro tecido vegetal. A cultura de tecidos é a forma mais comum de reprodução e clonagem de plantas em estufas. A cultura de tecidos pode ser usada para reproduzir plantas que demonstram resistência excepcional a doenças, ou alguma outra característica desejada. O tecido cultivado pode consistir em uma única célula, uma população de células, e uma parte de um órgão. As células em cultura podem se multiplicar; mudar o tamanho, Formato, exibir atividade especializada; ou interagir com outras células.

As técnicas de cultura de tecidos são freqüentemente usadas para a produção comercial de plantas, bem como para a pesquisa de plantas. A cultura de tecidos envolve a utilização de pequenos pedaços de tecido vegetal, que são cultivados em um meio nutriente em condições estéreis. Usando as condições de crescimento adequadas para cada tipo de explante, as plantas podem ser induzidas a criar novos brotos rapidamente, e, com a adição de novas raízes de hormônios adequados. Essas mudas podem ser divididas, para produzir um grande número de novas mudas. As novas plantas podem ser colocadas no solo e cultivadas da maneira normal. Meio de cultura de tecido , é um grupo de sistemas usados ​​para cultivar células vegetais, tecidos ou órgãos sob condições estéreis em um meio de cultura nutriente de composição conhecida. A cultura de tecidos vegetais é amplamente utilizada para gerar clones de uma planta em um método conhecido como micropropagação.

Importância da cultura de tecidos:

• Em um tempo e espaço relativamente curtos, um grande número de plântulas pode ser produzido a partir de um único explante.
• Tirar um explante geralmente não destrói a planta-mãe, portanto, plantas raras e ameaçadas de extinção podem ser clonadas com segurança.
• É fácil selecionar as características desejáveis ​​diretamente da configuração da cultura (in vitro), diminuindo assim a quantidade de espaço necessária, para ensaios de campo.
• Uma vez estabelecido, uma linha de cultura de tecidos pode fornecer um suprimento contínuo de plantas jovens ao longo do ano.
• O tempo necessário é muito reduzido, não quero esperar por todo o ciclo de vida de desenvolvimento da semente. Para espécies que têm tempos de geração longos, estágio baixo de produção de sementes, ou sementes que não germinam prontamente, a propagação rápida é possível.
• Plantas em crescimento in vitro geralmente gratuitas, das doenças bacterianas e fúngicas. Erradicação de vírus e manutenção de plantas no estado livre de vírus. Isso facilita o progresso da planta através das fronteiras internacionais.
• Os bancos de cultura de tecidos de plantas podem ser congelados e regenerados por meio de cultura de tecidos. Ele preserva as coleções de pólen e células das quais as plantas podem ser propagadas.

Tipos de cultura de tecidos:

Cultura de Semente

A cultura de sementes é o tipo de cultura de tecidos usado principalmente para plantas como orquídeas. Para este método, explantes são obtidos de uma planta derivada in vitro e introduzidos em um ambiente artificial, onde eles podem proliferar.

Cultura Embrião

A cultura de embriões é o tipo de cultura de tecidos que envolve o isolamento de um embrião de um organismo conhecido para crescimento in vitro. A cultura de embriões pode ocupar o uso de um embrião maduro ou imaturo. Considerando que os embriões maduros em cultura são obtidos principalmente de sementes maduras, envolve o uso de embriões imaturos de sementes híbridas que não germinaram. Ao fazer isso, o embrião é finalmente capaz de criar uma planta viável. Para cultura de embriões, o óvulo, semente da qual o embrião será obtido é esterilizada, e o embrião não precisa ser esterilizado novamente. A sacarose salgada pode ser usada para fornecer nutrientes ao embrião. A cultura do embrião é enriquecida com compostos orgânicos ou inorgânicos, sais inorgânicos, bem como reguladores de crescimento.

Cultura calosa

A cultura do calo é formada pela proliferação do tecido original. As células de um calo são parenquimatosas, amorfo e desorganizado. Geralmente, A cultura do calo é formada como resultado de uma lesão nas pontas cortadas de um caule ou raiz. Um centro localizado de atividade é registrado em um calo.

Cultura do órgão:

Isso pode permitir a diferenciação e preservação da arquitetura. A cultura de órgãos refere-se à cultura in vitro e manutenção de um órgão primordial excisado ou todo ou parte de um órgão na forma e função.

Cultura antera

Androgênese é o desenvolvimento in vitro de plantas haplóides originadas de potentes grãos de pólen por meio de uma série de divisão e diferenciação celular.

Embriogênese somática

Este é o processo de uma única ou grupo de células iniciando a via de crescimento que leva à regeneração reprodutível de embriões monozigóticos capazes de germinar para formar plantas completas.

Processamento de células e tecidos cultivados:

Culturas vivas podem ser examinadas diretamente com um microscópio, ou eles podem ser observados por meio de fotografias e filmes tirados através do microscópio. Células, tecidos, e os órgãos podem ser mortos, fixo, e corado para exame posterior. Após a fixação, as amostras podem ser incorporadas e cortadas em seções finas para revelar detalhes adicionais em um microscópio de luz ou eletrônico.

As células em cultura de tecidos de plantas são submetidas a uma ampla gama de tratamentos experimentais. Por exemplo, vírus, drogas, vitaminas, microrganismos causadores de doenças podem ser adicionados à cultura. Os cientistas então observam as células, procurando por mudanças globais no comportamento celular para mudanças em moléculas específicas, como alterações na expressão de uma determinada proteína.

Insights biológicos:

A cultura de tecidos vegetais possibilitou inúmeras descobertas nas ciências biológicas. Revelou, informações básicas sobre as células quanto à sua composição e forma; sua bioquímica, genético, e atividade reprodutiva; e sua nutrição, metabolismo, funções especializadas. Também são processos de envelhecimento e cura; os efeitos nas células do físico, químico, e agentes biológicos; e as diferenças entre células normais e células anormais, como as células cancerosas. O trabalho com culturas de tecidos vegetais ajudou a reconhecer infecções, e anormalidades cromossômicas, para categorizar tumores, e para formular e testar medicamentos e vacinas.

Desde a descoberta de que certos vírus crescem em cultura de tecidos, a técnica tem sido usada para produzir vacinas contra a poliomielite, sarampo, caxumba, e outras doenças infecciosas. As culturas de células produziram inibidores virais, incluindo interferon. Os hormônios são produzidos a partir de culturas de células ou órgãos. Os glóbulos brancos cultivados de dois indivíduos podem ser usados ​​para determinar a compatibilidade entre potenciais doadores e receptores de transplantes de tecido.

Principais etapas da cultura do tecido vegetal:

Fase de iniciação:

A fase de iniciação é a primeira parte da cultura do tecido vegetal. Aqui, o tecido de interesse é obtido e esterilizado para evitar que qualquer microrganismo afete o processo. É nessa fase que o tecido é iniciado na cultura.

Fase de multiplicação:

A fase de multiplicação é a segunda etapa da cultura de tecidos, onde o material da planta in vitro é redividido e, em seguida, introduzido no meio. Aqui, o meio é composto de componentes apropriados para o crescimento, incluindo reguladores e nutrientes. Eles são responsáveis ​​pela proliferação do tecido e pela criação de vários brotos.

Alongamento:

As plantas são transferidas novamente, na capa de fluxo laminar, em um meio que torna os brotos alongados. Este é o estágio em que os caules das plantas crescem em comprimento e começam a se parecer com pequenas plantas.

Formação de raízes:

É nesta fase que as raízes são formadas. Aqui, hormônios são necessários para induzir o enraizamento, e consequentemente plântulas completas. Isso pode ocorrer no trabalho de cultura de tecidos na estufa, dependendo da espécie. Os brotos alongados são aparados do tecido de base e colocados em mídia que contém auxinas, para enraizar. Uma vez que as raízes são visíveis, as plantas podem ser plantadas na estufa. As plantas provenientes do ambiente de laboratório têm crescido em altas umidades relativas e são muito tenras. Eles devem ser examinados com muita atenção quando são movidos para a estufa para garantir que estão se aclimatando adequadamente.

Equipamento usado para cultura de tecidos:

A propagação por cultura de tecidos requer uma série de equipamentos de laboratório. Os vários equipamentos e suas funções são;

Autoclave: A esterilização de todos os aparelhos de vidro e meios de cultura pode ser realizada por meio do vapor gerado na autoclave.

Balanças analíticas ou superiores: Para uma medição precisa dos diferentes constituintes dos meios de cultura, esses saldos seriam necessários. O equilíbrio da bandeja superior é usado para medir quantidades maiores, enquanto a balança analítica é usada para medir quantidades menores.

medidor de pH: É usado para medir e ajustar a concentração de íons de hidrogênio do meio de cultura ou solução. A concentração de íons de hidrogênio deve ser mantida com precisão para atingir o crescimento ideal das plantas.

Gabinetes laminar de fluxo de ar: Nestes gabinetes, os rebentos desenvolvidos nos explantes são separados dos aglomerados e transferidos para meio fresco em condições estéreis.

Conjuntos de destilação: A água a ser utilizada na preparação dos meios de cultura deve estar isenta de impurezas e sais.

Condicionadores de ar com estabilizadores: Manutenção da temperatura preferida na sala de crescimento, A sala de inoculação ou de transferência de cultura seria possível com ar condicionado nessas áreas.

Microscópios: a) Microscópio estéreo:Isso permitiria dissecar meristema de pequeno tamanho das pontas dos caules, removendo as capas protetoras dos primórdios da folha.

1. b) Microscópio composto:permite a detecção de bactérias e fungos em cultura e tecidos vegetais.

Unidade de lavagem de garrafas: Uma vez que um grande número de garrafas ou recipientes nos quais as plantas serão desenvolvidas devem ser lavados repetidamente antes do uso, uma unidade de lavagem automática de garrafas seria útil.

Bandejas: Estrutura de suporte para frascos ou recipientes de cultura.

Escotilhas: Passe por caixas usadas como porta de entrada entre a área limpa e a área semilimpa para a troca de materiais.

Kits de dissecação: Estes são necessários para a separação de brotos e preparação de microestacas.

Usos da cultura de tecidos vegetais:

A cultura de tecidos vegetais é usada para aumentar milhares de plantas geneticamente idênticas de uma única planta parental chamada clones de soma. Uma vez que este processo de micropropagação produz novas mudas na casa dos milhares, tem sido amplamente utilizado para a fabricação de plantas comercialmente importantes, incluindo plantas alimentícias como tomate , banana , e maçã , etc. Um exemplo de aplicação da micropropagação foi observado no cultivo de orquídeas, que cresceu exponencialmente devido à acessibilidade de milhões de mudas graças aos métodos de cultura de tecidos. Por que a cultura de tecidos de plantas é importante? Nesta cultura, o meio de crescimento ou solução de cultura é muito importante, pois é usado para o crescimento do tecido vegetal, pois contém vários nutrientes vegetais na forma de "geléia" conhecida como ágar e hormônios vegetais que são necessários para o crescimento das plantas.

Requisitos da cultura do tecido vegetal:

Escopo e treinamento da cultura de tecidos vegetais, é referido ao cultivo in vitro de plantas, sementes e várias partes das plantas (órgãos, embriões, tecidos, células únicas, e protoplastos).

A cultura de tecidos vegetais é uma das áreas de crescimento mais rápido da biotecnologia devido ao seu alto potencial para desenvolver plantações melhoradas e plantas ornamentais. Com os avanços da cultura de tecidos, tecnologia, agora é provável regenerar espécies de qualquer planta no laboratório. Para obter o objetivo de criar uma nova planta ou uma planta com as características desejadas, a cultura de tecidos é freqüentemente associada à tecnologia de DNA recombinante. As técnicas de cultura de tecidos vegetais ajudaram muito na revolução verde, melhorando o rendimento e a qualidade da colheita. As informações obtidas em culturas de tecidos vegetais contribuíram para a nossa compreensão do metabolismo, crescimento, diferenciação e morfogênese de células vegetais. Devido à ampla gama de aplicações, cultura de tecido vegetal atrai a atenção de biólogos moleculares, melhoristas e industriais de plantas. Quem introduziu a cultura de tecidos vegetais? No século 19, nasceu a ideia de experimentar tecidos e órgãos de plantas em condições controladas de laboratório. Pela primeira vez em 1902, um fisiologista alemão, Gottlieb Haberlandt, desenvolveu a teoria da cultura de células in vitro.

Em linha com a tecnologia e objetivo de propagação de cultura de tecidos, várias instalações também podem ser exigidas abaixo;

Terra: É necessário montar um laboratório, unidade da planta mãe, estufa e escritório. Pode ser necessário espaço para a instalação de poços tubulares ou poços cavados e estacionamento de veículos.

Plantas-mãe: As plantas mães forneceriam uma fonte de tecidos. Seu desempenho deve ser testado antes do uso, como fonte de explantes. Em caso de vínculo com laboratórios bem estabelecidos, explantes de plantas-mãe de teste podem estar disponíveis gratuitamente. De outra forma, coleção, manutenção e teste de plantas-mãe superiores seriam necessários.

Laboratório: Um laboratório de cultura de tecidos normalmente compreende uma sala de preparação de mídia, sala de armazenamento de mídia, sala de inoculação, sala de transferência de cultura, área de lavagem, etc. A planta baixa deve ser projetada para promover a eficiência máxima. O projeto deve facilitar a manutenção da temperatura ideal, umidade, iluminação e ventilação. O projeto correto de um laboratório não apenas reduzirá a contaminação, mas alcançará alta eficiência no desempenho do trabalho. Laboratórios planejados e projetados adequadamente podem reduzir os custos operacionais e de energia.

Estufa na cultura de tecidos: Na propagação de cultura de tecidos, uma estufa pode ser necessária para cultivar e manter as plantas-mãe de modo que o crescimento dos órgãos adequados para a cultura de tecidos seja máximo, especialmente no caso de plantas ornamentais, e para endurecer as mudas regularmente em um ambiente natural. A estufa permitirá o controle da intensidade da luz e da umidade, que é essencial para o endurecimento das plantas.

Eletricidade: Como ficaria evidente nos parágrafos anteriores, nenhum laboratório de cultura de tecidos pode funcionar sem eletricidade. A eletricidade é essencial para fornecer a intensidade de luz necessária para os tecidos e brotos em crescimento enquanto eles estão no laboratório, para operar vários equipamentos e instalações, que incluem condicionadores de ar.

Água: Água para o cultivo de plantas-mãe, endurecimento de mudas, cantina, banheiros, Água destilada é necessária para a preparação de meios de cultura e reagentes.

Matéria prima: Matérias-primas necessárias para o projeto de cultura de tecidos, além do explante, são diferentes constituintes dos meios de cultura.

Mão de obra qualificada: A cultura de tecidos vegetais é uma operação altamente qualificada. Seria, Portanto, É necessário que os funcionários do laboratório e da estufa sejam bem qualificados e experientes na tecnologia. Seu treinamento em laboratórios comerciais bem estabelecidos seria útil.

Estágios de cultura de tecidos vegetais:

Quais plantas são cultivadas por cultura de tecidos? As novas plantas podem ser colocadas no solo e cultivadas da maneira normal. Muitos tipos de plantas são apropriados para uso em sala de aula. Couve-flor , estacas de rosa, As folhas de violeta africana e hastes de cravo produzirão facilmente clones por meio de cultura de tecidos.

Preparação de meio nutriente

Um meio semissólido é preparado em água bidestilada contendo macroelementos, microelementos, aminoácidos, vitaminas, fonte de ferro, fonte de carbono como sacarose e fitohormônios. O meio é aquecido para dissolver o ágar e 25 ml a 50 ml são dispensados ​​em cada frasco de boca larga. Os recipientes contendo meios de cultura são então selados e esterilizados em autoclave.

Estabelecimento de cultura asséptica

O material de partida para o procedimento é geralmente uma ponta de rebento de crescimento ativo de um botão auxiliar ou terminal ou ponta de rebento de uma planta. O procedimento de cultura de tecidos vegetais começa a partir da seleção de plantas-mãe com as características desejadas.

Explantar, se possível, o tecido meristemático da planta-mãe selecionada é isolado. O tecido / explante excisado é lavado com água e, em seguida, enxaguado com um desinfetante, como solução de savlon ou Dettol, seguido por uma lavagem com água estéril. O tecido é então mergulhado em solução de lixívia a 10% por dez minutos para desinfetar o material de tecido da planta, matando a maioria dos organismos fúngicos e bacterianos. O procedimento de esterilização de explantes depende das espécies de plantas e tipos de explantes

Inoculação

O processo de inoculação é realizado em condições assépticas. Neste procedimento, os explantes ou microrromos são transferidos para o meio nutriente esterilizado.

Desenvolvimento de plantas na sala de crescimento

Após a inoculação do tecido da planta, as garrafas são seladas e transferidas para a sala de crescimento para desencadear um processo de desenvolvimento sob luz difusa de 23 a 27 ° C e 50 a 60% de umidade relativa. Os requisitos de luz e temperatura variam de espécie para espécie e, às vezes, durante os vários estágios de desenvolvimento.

As culturas são observadas diariamente quanto ao crescimento e quaisquer sinais de infecção ou contaminação. Culturas, que não apresentam crescimento excelente ou infectados, são descartados. As culturas saudáveis ​​desenvolvem-se em pequenos botões rebentos. Estes são subcultivados em meio fresco após quatro semanas. O número de subculturas necessárias é específico para as espécies de plantas, que são padronizados. Os brotos geralmente se desenvolvem após quatro semanas. Depois que um número suficiente de brotos é desenvolvido em cada recipiente, a uma altura mínima de 2 cm são transferidos para outro meio para iniciar o procedimento de enraizamento. O constituinte do padrão de enraizamento para cada espécie de planta é específico. As raízes geralmente se formam em duas a quatro semanas. As plantas nesta fase são delicadas e requerem um tratamento cuidadoso.

Endurecimento de micro plantas

Devido à umidade muito alta dentro do recipiente de cultura e às condições artificiais de desenvolvimento, as mudas estão macias e, portanto, não estão prontas para lidar com as condições do campo. As plantas removidas do meio estéril são lavadas e mantidas sob névoa intermitente ou cobertas com plástico transparente limpo. Após 10 a 15 dias sob alta umidade, as plantas são transferidas para a estufa e mantidas por mais 4 a 6 semanas. Eles são então concluídos para serem transferidos para uma nova casa ou campo. Normalmente, as plantas de cultura de tecidos vegetais são vendidas como plantas ex-ágar ou plantas endurecidas da estufa.

O procedimento de cultura de tecidos vegetais:

As partes da planta usadas para cultivo são chamadas de explantes. Os explantes são cultivados in vitro em um meio nutriente que atende para completar suas necessidades nutricionais. O meio nutriente deve fornecer o seguinte:-

1. Macronutrientes - Inclui elementos como nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K), cálcio (Ca), enxofre (S) que é necessário para o crescimento e morfogênese adequados.
2. Micronutrientes - Elementos como o ferro (Fe), manganês (Mn), zinco (Zn), etc, que é crucial para o crescimento dos tecidos.
3. Fonte de carbono ou energia - este é um dos principais ingredientes cruciais da mídia de nutrientes. A sacarose é a fonte de carbono amplamente utilizada entre outros carboidratos.
4. Vitaminas, aminoácidos, e outros sais inorgânicos.

Os meios de cultura também servem como um meio para fornecer reguladores de crescimento de plantas para os problemas que ocasionam sua morfogênese conforme a necessidade. Os tecidos dos explantes primeiro perdem sua especificidade para formar uma protuberância marrom dura chamada calo. O calo então se divide para aumentar um órgão da planta ou uma planta totalmente nova dependendo da quantidade e composição dos fitohormônios fornecidos. Todo o procedimento requer condições assépticas estritas a serem mantidas em todos os momentos, pois uma única contaminação pode arruinar um lote inteiro de plantas. Por que a cultura de tecidos é chamada de micropropagação in vitro? A cultura de tecidos é um método de propagação usado para gerar plantas em condições estéreis. É chamado de micropropagação in vitro, Porque, os explantes são cultivados em meio e os recursos genéticos são conservados na forma de. As plantas micropropagadas são isentas de vírus e apresentam produtividade e rendimento aumentados.

Vantagens da cultura de tecidos vegetais:

Multiplicação em massa de clones de elite: A micropropagação permite a criação de um grande número de plantas a partir de pequenos pedaços da planta-mãe. A produção requer períodos de tempo moderadamente curtos para o cultivo das plantas. Dependendo das espécies em produção, uma ex-planta pode ser multiplicada em vários milhares de plantas em menos de um ano.

Melhoria da planta por meio da cultura de tecidos: A criação de variedades superiores de culturas agrícolas é possível através do método de cultura de tecidos de plantas, o que de outra forma não é possível durante os métodos convencionais de melhoramento de plantas.

True to Type production: a Large number of true to the type plants can be propagated within a short time and space and that too throughout the year. Por exemplo, it may be possible to propagate 2 to 4 lakhs of tissue cultured plants from a single bush or rose against 10 to 15 plants by conventional means. Também, it may take about 2 to 4 months to produce a healthy planting material by tissue culture means, whereas a minimum of 6 to 8 months is required for most species by the latest method of plant propagation.

Higher yields: Tissue Culture Plants may have increased branching &flowering, greater vigor and higher yield, mostly due to the possibility of elimination of diseases.

Beneficial when conventional propagation is difficult: The process may succeed to propagate plants where seeds or conventional propagation is not possible or undesirable.

Flexible method: The flexibility of nurseries can be better. As the capital investment on the mother plant is reduced to almost zero, it can be easier to adapt to changing conditions.

The innovation of new varieties: Plant tissue culture can be utilized for breeding new varieties.

Financial assistance in Tissue culture:

The tissue-culture export-oriented developments are eligible for refinance support by NABARD. Banks can provide loans for the activity provided the scheme is technically feasible &financially viable.

Bank Loan:

A bank loan of 75 to 80 % of the total cost of development shall be available from the financing institution. Bank loan considered in the model is 75%.

The rate of interest:

Banks are free to choose the rate of interest within the overall RBI guidelines issued from time to time. Contudo, the final lending rate has been considered as 12% for working out the bankability of the model project.